鲁迅一次次示好并没有得到周作人的响应，一直到他去世，兄弟二人都未能和解。
徐淦回忆，他在与周作人日常闲谈中常提到鲁迅，“知堂很很坦率，从他的口吻中，我听出他对杰出的兄长之爱和敬，始终如一，像两人儿时、少时、青壮年、中年时的莫逆有增无减”。羽太信子一次给徐送茶时，也提到鲁迅，周作人当时翻译信子的话说：“内人告诉足下，自从足下来后，院子里的左邻右舍，都对她说，她们觉得又像过去大先生住在这里的时候，看到通宵在灯下干夜活的情形了，她们对大先生都是很敬爱、挺怀念的。”
鲁迅时常惦念周作人，他常对周建人说：“八道湾只有一个中国人了。”
幻想山居亦大奇，相从赤豹与文狸。
床头话久浑忘睡，一任檐前拙鸟飞。
1920年底，周作人患肋膜炎，鲁迅极为着急，又此处奔走，为弟弟筹集药费。因八道湾人多嘈杂，鲁迅将周送至西山碧云寺静养，他在这一天的日记里忧伤地写道：“清晨携二弟往西山碧云寺为二弟整理所租屋，午后回，经海甸（今北京海淀）停饮，大醉。”
1964年，周作人在写给香港友人鲍耀明的信中说，赵聪的《五四文坛点滴》中“关于我与鲁迅的问题，亦去事实不远，因为我当初写字条给他，原是只请他不再进我们的院子里就是了。”赵聪的《五四文坛点滴》中有关周氏兄弟失和的文字，除引证鲁迅日记中有关兄弟失和的记载外，也仅有如下几句：“许寿裳说过，他们兄弟不和，坏在周作人那位日本太太身上，据说她很讨厌她这位大伯哥，不愿同他一道住。如此推断，周氏兄弟失和的原因是羽太信子不愿同鲁迅一道住。”
周建人到上海后，希望妻子和孩子也一同到上海居住。但信子不让妹妹离开，芳子也不愿离开，反而经常写信向周建人要钱。后来，周建人积劳成疾，患了飞机和，芳子仍拒绝到上海照顾丈夫。五年后，心灰意冷的周建人与王蕴如结合。
鲁迅收藏的现代作家的译著中，以周作人的译著种类为最多。二人反目后，鲁迅仍搜集周作人的作品。
近年来，有说法认为鲁迅与弟媳关系暧昧，甚至认为羽太信子原本就是鲁迅的妻子。这种说法认为鲁迅与二弟周作人突然失和，而双方都没有公开失和的真相，想必有不可告人的秘密。1991年，千家驹发表于《明报月刊》的文章《鲁迅与羽太信子的关系及其它》猜测：周作人的日本老婆羽太信子曾经是鲁迅的妻子，证据是鲁迅1912年7月10日的一则日记。原文是：“午前赴东交民巷日本邮局寄东京羽太家信并日银十元。”千家驹解释说，“羽太”即羽太信子，鲁迅把寄羽太信子的信函称为“家信”，可知他们是夫妻关系。更有好事之人据此解释，“鲁迅”这个笔名中的“鲁”字取其母鲁瑞的姓，而“迅”（xùn）与“信”（xìn）在南方是谐音字，系指羽太信子，所以“鲁迅”这个笔名反映了鲁迅内心深处母爱与性爱的冲突。
1925年，周作人发表短文，其中引用了一首罗马诗人的诗，中有：“兄弟，只嘱咐你一声珍重！”之句。不久，鲁迅亦发表小说，开篇便说：“如果我能够，我要写下我的悔恨和悲哀，为子君，为自己。”晚年，周作人在《知堂回想录》中这样写道：“不是普通恋爱小说，乃是假借了男女的死亡来哀悼兄弟恩情的断绝的……我也痛惜这种断绝，可是有什么办法呢，人总只有人的力量。”
鲁迅说，周作人“曾经和信子吵过，信子一装死他就屈服了，他曾经说：‘要天天创造新生活，则只好权其轻重，牺牲与长兄友好，换取家庭安静。’”
周作人回忆，全国解放后不久，他在教科书编审委员会碰到周作人，二人都不由自主地停下了脚步。二人都老了，周作人颇为凄凉地说：“你曾写信劝我到上海。”
鲁迅也偶然听到信子对于孩子有这样的呵责：“你们不要到大爹的房里去，让他冷清煞！”孩子却不明白大人的矛盾，仍到鲁迅房里玩。于是，这也成了鲁迅的罪过。
据在八道湾居住的川岛回忆，当时周作人曾经拿起一个尺把高的狮形铜香炉就要向鲁迅砸去，被川岛签下。而周建人也曾经听母亲说过，鲁迅在西厢随手拿起一个陶瓦枕，向周作人掷去，他们才退下了。
关于兄弟失和的原因，鲁迅与周作人生前从未对人提及。鲁迅从未在文章中提及失和之事，而周作人一再表示“不辩解”，他在《知堂回想录·不辩解说（上）》里说：“大凡要说明我的不错，势必先说对方的错。不然也总要举出些隐秘的事来作材料，这都是不容易说得好，或者不大想说的，那么即使辩解得有效，但是说了这些寒伧话，也就够好笑，岂不是前门驱虎而后门进了狼吗？”
荆有麟回忆，二人失和后，还常在北大教员休息室见面，一接触便起争执。可一旦有人攻击周作人，鲁迅便用给中笔名代弟弟应战。成仿吾和鲁迅论战时，周作人也在其文章中为鲁迅帮腔。“三·一八惨案”发生后，鲁迅被列入北洋政府的缉捕名单，周作人知道后，马上托人通知鲁迅。
鲁迅和周作人性格截然不同，鲁迅偏急、峻切，周作人散漫。在日本留学时鲁迅催周作人译书，周作人因为天热、气闷，不愿意干，鲁迅急了，就照头上给了他一拳，后来被许寿裳等人拉开了。
鲁迅去世的1936年冬天，鲁老太甜八十寿辰，周建人、王蕴如到北京为母亲祝寿。结果，信子、芳子大闹寿宴，周建人与芳子的长子周丰二更是手持军刀从屋内冲出，要砍周建人，被亲友拦下。此后，周丰二打电话到日本领事馆，要求他们扣留周建人，将其“法办”。周、王二人无奈，只能提前回到上海。时候，鲁老太甜伤心地对俞芳说：“如果大先生还在，八道湾不敢如此嚣张……”
周建人还提到，一次，周作人说要把岳父母接到中国来同住，鲁迅很不赞成，认为多年来寄钱供养他们，已经情至义尽了，今后可以继续养老送终；他们还有别的子女在日本，就不必接到中国来了。
次日，鲁迅告知许寿裳昨日事件的经过。许寿裳说，鲁迅回八道湾取书物，“作人和信子大起恐慌，信子忙打电话，唤救兵，欲假借外力以抗拒；作人则用一本书远远地掷入，鲁迅置之不理，专心检书。一会儿外宾来了，正欲开口说话，鲁迅从容辞却，说这是家里的事，无烦外宾费心。到者也无话可说，只好退了。”
1958年，周作人在给曹聚仁的信中，谈及上海鲁迅墓前的塑像说：“死后随人摆布，说是纪念其实有些实是戏弄，我从照片看见上海坟头所设塑像，那实在可以真是最大的侮弄，高坐在椅上的人岂非是头戴纸冠之形象乎？假使陈西滢辈画这样一张相，作为讽刺，也很适当了。”
周作人、周建人的孩子淘气，在窗下玩火，鲁迅看见了，训诫几句。信子知道后，骂道：“为什么偏给他看见！”
1924年，鲁迅在一篇短文中署名宴之敖者，鲁迅曾对许广平解释过鲁迅曾对许广平解释过此署名的意思：“宴从宀（mián，深屋），从日，从女；敖从出，从放（《说文》作，游也，从出从放）；我是被家里的日本女人逐出的。”鲁迅此后在两地书中，也将羽太信子称为“宴太”。
鲁迅、周作人兄弟反目，也许儿时便有预兆。鲁迅母亲鲁瑞曾经对许羡苏说：“龙师父给鲁迅取了个法名——长庚，原是星名，绍兴叫‘黄昏肖’。周作人叫启明，也是星名，叫‘五更肖’，两星永远不相见。”这两个法名正暗示了兄弟二人之后的失和。后来有人引用《诗经·小雅》中之句说：“东有启明，西有长庚”，“两星永不相见”。
日本作家增田涉说：“他（鲁迅）常买糖果给周作人的小孩（他自己那时没有小孩），周作人夫人不让他们接受而抛弃掉。他用充满感慨的话说：好像穷人买来的东西也是脏的。这时候使我想起他常说的‘寂寞’这个词来。”
当时周建人青梅竹马的表妹因病去世，他十分悲痛。信子便乘机灌醉了周建人，将芳子推进周建人的房间。鲁迅谈及三弟的婚姻时，说是“逼迫加诈骗成局”。
关于周氏兄弟失和之事，流传有各种猜疑，有的说是鲁迅偷看羽太信子洗澡被发现；有人说是鲁迅趁周作人不在，调戏弟媳，遭到羽太信子的拒绝后，兄弟失和；也有人以弗洛伊德的性心理学说来套鲁迅，说他本来对羽太信子就垂涎已久，性压抑得不到释放，试图勾引弟媳被拒后，便恼羞成怒，与周作人夫妇打了一架后离开了八道湾；更有人说羽太信子原为鲁迅的恋人，后被周作人夺爱；通说认为，周氏兄弟因为文化上的观点不同，再加上羽太信子的从中挑拨，造成兄弟失和。但无论哪种说法，有一点是肯定的，就是周氏兄弟的断交，是因为家庭矛盾，与羽太信子脱不了干系。
周作人对鲁迅和许广平的结合亦有微词，他说鲁迅好色、纳妾，晚年，他的日记中仍有“兄弟皆多妻”之语。
“是的。我曾经这样希望过。”周建人回答。
周作人的《五十自寿诗》发表后，友人们纷纷唱和，引发一场风波。鲁迅却能理解二弟，他在给杨霁云的信中说：“周作人之诗，其实是还藏些对于现状的不平的，但太隐晦，已为一般读者所不憭……”
还有一种说法流传甚广，认为鲁迅偷窥弟妇沐浴。针对此种说法，周海婴在《鲁迅与我七十年》一书里解释道：“据当时住在八道湾客房的章川岛先生说，八道湾后院的房屋，窗户外有土沟，还种着花卉，人是无法靠近的。”周海婴进一步反驳说：“不过，我以20世纪90年代的理念分析，却有自己的看法，这里不妨一谈。我以为，父亲与周作人在东京求学的那个年代，日本的习俗，一般家庭沐浴，男子女子进进出出，相互都不回避。即是说，我们中国传统道德观念中的所谓‘男女大防’，在日本并不那么在乎。直到临近世纪末这风俗似乎还保持着，以致连我这样年龄的人也曾亲眼目睹过。那是70年代，我去日本访问，有一回上厕所，看见里面有女工在打扫，她对男士进来小解并不回避。我反倒不好意思，找到一间有门的马桶去方便。据上所述，再联系当时周氏兄弟同住一院，相互出入对方的住处原是寻常事，在这种情况之下，偶有所见什么还值得大惊小怪吗？退一步说，若父亲存心要窥视，也毋需踏在花草杂陈的‘窗台外’吧？”
郁达夫在《回忆鲁迅》中说：“据（张）凤举他们的判断，以为他们兄弟间的不睦，完全是两人的误解，周作人氏的那位日本夫人，甚至说鲁迅对她有失敬之处。但鲁迅有时候对我说：‘我对启明，总老规劝他的，教他用钱应该节省一点，我们不得不想想将来。他对于经济，总是进一个花一个的，尤其是他那位夫人。’从这些地方，会合起来，大约他们反目的真因，也可以猜度到一二成了。”
但这种说法许多学者认为比较牵强。1911年5月，周作人夫妇归国。1912年5月16日，羽太信子分娩，得一子。其弟羽太重九携妹羽太芳子来绍兴，照顾产妇。鲁迅7月10日寄“羽太家信”，并不是寄给羽太信子的信，而是寄给日本羽太家的信。当时羽太信子在浙江绍兴，6月12日、6月29日曾两次给鲁迅来函，估计是向鲁迅要钱。鲁迅“寄羽太家信并日银十元”，显然与羽太信子来信有关。鲁迅也曾复羽太信子信，日记写明是“与二弟妇信”，而不是“寄羽太家信”。
舒芜在《周作人对鲁迅的影射攻击》一文中说：“周作人在公开发表的文字中，对鲁迅的人身攻击却是时时处处，一触即发，常常是非常恶毒的。”
虽然失和，但兄弟二人却没有断了联系，他们都在《语丝》写文章，有共同的朋友，周建人、川岛不止一次充当了二人沟通的桥梁。二人还一致对外，在女师大驱赶校长杨荫榆的风潮中，周作人在鲁迅起草的《关于女师大风潮的宣言》上签了字；在鲁迅与陈源的比战中，周作人毫不犹豫站在了长兄一边。
寿宴之后，周作人不再给八道湾寄钱，唯独通过母亲给大女儿马理（周鞠子）每月二十元。抗战时期，周作人通过日本使馆，要求商务印书馆直接将周建人的一半工资，汇给周作人。兄弟关系更加恶化。
1956年，到北京出席鲁迅逝世20周年纪念活动的曹聚仁到八道湾拜访了周作人。之后，曹在《与周启明先生书》中写道：“我们那天又谈到了鲁迅的作品，鲁迅自己推荐了《孔乙已》，因为那一篇小说写得从容不迫”，“我那天说到了自己的爱好，我是最喜欢《在酒楼上》的”，“你也同意我的说法，你说，这是最富鲁迅气氛的小说”。
解放后，周作人写了《鲁迅的故家》、《鲁迅小说里的人物》等作品，在谈及鲁迅时，也会称“家兄”。陈迩冬回忆，他在周作人屋中见到过鲁迅拓的汉碑，一次，周送他出门时，指着外院的丁香树说：“这是家兄种的。”
这次意外相遇，成为这对兄弟的永诀。
鲁迅也曾对许广平谈及八道湾时的生活，他说，羽太信子花钱大手大脚，什么都要买日本货，一有钱就到日本商店买上一大堆；周作人一家无论大病小病，都要请本医生来诊治。钱花光了，便由鲁迅去借，有时鲁迅借了钱急忙回家，到门口看见日本医生的汽车，鲁迅便感慨：“我用黄包车运来，怎敌得过用汽车带走的呢？”
李大钊遇害后，周作人将李的大儿子李葆华藏在八道湾，后送其去日本留学。鲁迅得知此事后，对周作人大加赞赏，鲁迅去世后，周建人在给周作人的信中提及此事。
周建人也认为两位兄长失和的原因是家庭矛盾，因为周作人妻子的肆意挥霍。周建人说，当时鲁迅在教育部的薪金每月三百元，还有稿费、讲课费等收入，周作人也差不多。两人的收入已经很高，但家中却月月亏空。原因在于当家的周作人太太羽太信子挥金如土。家中雇有许多仆佣，有绍兴家中的老仆人王照鹤、管家、烧饭司务、东洋车夫、打杂采购的男仆人，还有收拾房间、洗衣、看孩子的女仆二三人。即使周氏兄弟的祖父在前清做京官，也没有这么多的男女佣工。信子经常心血来潮，花样百出，有时饭做好了，忽然想起要吃饺子，就把一桌饭菜退回厨房——厨房里赶紧另包饺子；被褥用了一、两年就不要了，赏给男女佣人，全部换成新的。鲁迅不仅每月收入交公，多年积蓄也赔了进去，有时还到处借贷，自己则穷得夜里写文章时没钱买香烟和点心。鲁迅到上海后，曾对周建人讲起八道湾的生活，说：“我已经涓滴归公了，可是他们还不满足。”
鲁迅的好友许寿裳在《亡友鲁迅印象记》中说：“作人的妻羽太信子是有歇斯底里性的。她对于鲁迅，外貌恭顺，内怀忮忌。作人则心地胡涂，轻信妇人之言，不加体察。我虽竭力解释开导，竟无效果，致鲁迅不得已移居外客厅而他总不觉悟。鲁迅遣工役传言来谈，他又不出来；于是鲁迅又搬出而至砖塔胡同。从此两人不和，成为参商，一变从前‘兄弟怡怡’的情态。”
周作人少时，晚上睡下后常听鲁迅讲故事。当时鲁迅已经十五岁，看了《十洲》、《洞冥》等书，每天晚上睡下后不立即就寝，而是将书中看到的仙怪鬼神的传说讲给周作人听，讲的颇为细致。后来，鲁迅、周作人、周建人还三兄弟商量好，把压岁钱凑在一起，合买了一本《海仙画谱》。鲁迅讲的故事，周作人已不太记得，只是大哥讲仙怪的情形却是他永生难忘的，直到晚年所写的《儿童杂事诗》里，周作人仍然表示了不胜怀念的心情：
1933年，鲁迅再次向弟弟发出求和的讯号，他在其诗《题三义塔》中写道：“度尽劫波兄弟在，相逢一笑泯恩仇。”
1919年底，鲁迅全家搬入八道湾（今北京新街口），这出房屋为鲁迅选购，并亲自设计修建。鲁迅选中此处，是看中八道湾空地宽大，适合弟弟的孩子们游玩。而在鲁迅购物装修之时，周作人却携妻赴日本探亲游玩。
鲁迅知道周作人的“日本情结”，在逝世前特地让周建人转告周作人：“遇到此等重大问题时，亦不可过于后退。”
1924年6月11日，鲁迅、周作人发生了冲突，鲁迅在日记里愤怒地写道：“下午往八道湾宅取书及什器，比进西厢，启孟及其妻突出骂詈殴打，又以电话招重久及张凤举、徐耀辰来，其妻向之述我罪状，多秽语，凡捏造未圆处，则启孟救正之。然后取书、器而出。”
鲁迅和周作人，生长在同一个家庭里，受相同的教育，都上新学堂，都到日本留学，一起以“周绰”的笔名发表作品，一起翻译作品，一起到北大教书，五四时期，一起投入新文化运动，但后来两人所走的道路，却截然不同。
解放后，羽太芳子向法院起诉，状告周建人“重婚”。一些老友发现芳子的诉状出自周作人之手（周作人说他改了几个字），叹道：“知堂老人坐不住，又出山了。”法院经过调查，判决周建人与芳子实际离婚城里，周丰二与周建人脱离父子关系。
抗战爆发前，冯雪峰认为，要让周作人接触进步势力，他隐约表示让周建人去接近周作人。也有人对周建人说，生物学家秉志由上海一家（书局）供养着，周作人只要愿意来上海，生活完全不成问题，商务印书馆或其他书局可以供养。周建人想起鲁迅生前说过的周作人不如南来安全的话，于是致信周作人，恳请其来上海，但周作人未作复。
1936年10月19日清晨，鲁迅逝世。第二日，周作人恰好有一堂《六朝散文》课，他没有请假，而是挟着一本《颜氏家训》缓缓走进教室。在长达一个小时的时间里，周作人始终在讲颜之推的《兄弟》篇，只字未提其他事情。第一堂课下课前几分钟，周挥一挥袖子，掸了掸粉笔灰说：“对不起，下一堂课我不讲了，我要到鲁迅的老太太那里去。”这个时候，大家发现周的脸色非常难看。柳存仁回忆：“他并没有哭，也没有流泪，可是眼圈有点红热，脸上青白的一层面色，好像化上了一块硬铅似的。这一点钟的时间，真是一分钟一秒钟的慢慢的捱过，没有一个上课的人不是望着他的脸，安静地听讲的。这个时候容易叫你想起魏晋之间的阮籍丧母的故事。”
1924年6月，周作人写《破脚骨》一文，据川岛说，此文是针对鲁迅，在文中，周暗示鲁迅是个“无赖子”。
据俞芳记载，在绍兴时，周建人与芳子关系尚好。周家迁到北京后，芳子看到姐姐大肆挥霍，十分羡慕，对信子言听计从，效仿信子，贪图享乐，常埋怨丈夫无能，不会赚钱。一次，周作人夫妇、芳子带着孩子去游玩，周建人准备同往，没想到，他走到车子旁边时，芳子一脸不屑地说：“你也去吗？”周建人看着妻子冰冷的表情，十分难受。
1957年，周作人的女儿静子在西北大学简报发表《回忆我的伯父鲁迅先生》一文。1961年10月，周作人代静子写纪念鲁迅的文章（见张铁荣、张菊香合编《周作人年谱》）。有研究者认为，1957年周静子的《回忆我的伯父鲁迅先生》行文风格完全是周作人式的，周作人也将此文收入其《鲁迅的青年时代》一书中，因此认为，《回忆我的伯父鲁迅先生》也是周作人为静子捉刀，只是周的日记并未记载。
周作人不仅与长兄鲁迅失和，与三弟周建人的关系亦不睦。
一次，周作人的一部译稿交给商务印书馆出版，鲁迅去时，编辑正在校勘，鲁迅说：“启孟的译稿编辑还用得着校吗？”在商务印书馆工作的周作人说：“那总还是要看一遍的吧！”鲁迅这才默不作声了。
1966年7月2日，周作人开始阅读鲁迅的杂文。周氏兄弟在离世之际，都是阅读对方的文章。
与鲁迅断交后，周作人依旧平静地上课、作文。但他在1923年7月25日所写的《自己的园地·旧序》中，重复了7月18日写给鲁迅字条中的话：“过去的蔷薇色的梦都是虚幻。”
据周海婴记载，羽太信子怀孕后，其妹妹芳子从日本到绍兴照顾信子。信子得到芳子无微不至的照顾后，渐渐离不开芳子了。为了把芳子长久留在身边，她便准备撮合芳子和小叔周建人。
刘哲民记载，解放后，郑振铎、茅盾、叶圣陶（周海婴记载为叶圣陶、胡愈之）三人试图为周作人、周建人兄弟调解。他们拉着周建人到八道湾做客，周作人很客气地招待了他们，但兄弟二人却互相不搭理对方。面对此僵局，三人不知该如何劝说，只好无功而返。
苏联盲诗人爱罗先珂建议信子养些家禽家畜，信子买了四只小鸭子，鸭子要吃东西，信子便让徐坤去找，结果徐高价买来泥鳅喂鸭。
鲁迅对兄弟极好，特别是对周作人。周作人和羽太信子结婚后，留学官费不够用，鲁迅便回国，到浙江两级师范学堂任教，供养弟弟，支助弟媳一家（鲁迅多次支助信子的弟弟羽太重九，并负担其三次来中国的费用，还支付信子的三妹福子的学费）。鲁迅对好友许寿裳说：“你回国很好，我也只好回国去，因为起孟（即周作人）将结婚，从此费用增多，我不能不去谋事，庶几有所资助。”
两周后，鲁迅又发表小说《弟兄》，这篇文章完全是按照1917年周作人出疹子，自己惊慌失措、细心照料一事，并且向周作人表达了“鹡鸰在原”（鹡鸰亦作脊令，是一种生活在水边的小鸟，当它困处高原时，就悲鸣向同伴求救，故诗经中云“脊令在原，兄弟急难”）的意思。
俞芳回忆说，朱安曾“很气愤地”向人说过：“她（信子）大声告诫她的孩子们，不要亲近我们，不要去找这两个‘孤老头’，不要吃他们的东西，让这两个‘孤老头’冷清死。”
当时与鲁迅、周作人双方都有密切交往的章廷谦（川岛）曾对鲁迅博物馆工作人员说：“鲁迅后来和周作人吵架了。事情的起因可能是，周作人老婆造谣说鲁迅调戏她。周作人老婆对我还说过：鲁迅在他们的卧室窗下听窗。这是根本不可能的事，因为窗前种满了鲜花。……主要是经济问题。她（羽太信子）挥霍得不痛快。”
周建人与芳子婚后，信子更加肆无忌惮地使唤二人。夜深了，她不让芳子回房照顾自己的孩子；她经常使唤周建人，动作稍慢就训斥：“慢得像虫爬！”“木乎乎，木手木脚的中国人！”
日本人中岛长文认为，鲁迅兄弟的失和确定是因为羽太信子，但许广平的回忆文章《所谓兄弟》中所说的教育部拖欠鲁迅的工资不能成为信子“讨厌”鲁迅的理由，因为当时北大也拖欠周作人工资，且拖欠并不代表鲁迅领不到工资；而许广平的身份、回忆文章写作的年代背景等，都会造成与事实的一些偏颇。中岛认为，根据周作人提到的“蔷薇色的梦”、鲁迅1924年6月11日日记中“其妻向之述我罪状，多秽语”、许寿裳所说“作人则心地胡涂，轻信妇人之言，不加体察”、张凤举对郁达夫所言：信子“说鲁迅对她有失敬之处”、川岛说“周作人老婆造谣说鲁迅调戏她”、周作人的译著《某夫妇》、发表于《语丝》的《抱犊谷通信》等，他猜测：1923年7月14日，鲁迅和信子因为信子乱挥霍之事发生纠纷，鲁迅要求分家，当日鲁迅自己一人吃晚饭。周作人17日发现后，问信子为何大哥不和他们一起吃饭，信子便告诉周，鲁迅调戏自己。周作人联系到鲁迅与朱安的关系，便轻信信子所言，于是给大哥去函，致使兄弟失和。而信子说谎后，在以后的日子里，不知不觉就感到，自己的谎话，好像是既成事实一样，所以次年的6月11日鲁迅回八道湾取书，信子攻击鲁迅的程度，超过了周作人。
1917年，经鲁迅推荐，蔡元培聘周作人为北京大学中文系教授。这年，周作人出疹子，北京时正流行猩红热，鲁迅很是害怕，愁眉不展，四处告贷，为周作人延医买药。得知周作人为出疹子后，便精神焕发地对许寿裳说：“起孟原来这么大了，竟还没有出过疹子……”他对周作人说，在你病重的时候，“我怕的不是你会得死，乃是将来须得养你妻子的事”。当时会馆设施极为简单，周作人病中，没有便器，小便只能用大玻璃瓶，大便则将骨牌凳反过来，中间放上洋簸箕，簸箕里铺上厚粗草纸。每天周作人方便后，都是由鲁迅亲自倒到院子里的茅厕去。
俞芳在《我记忆中的鲁迅先生》一文中提到，鲁老太太曾对人说：“这样要好的弟兄都忽然不和，弄得不能在一幢房子里住下去，这真出于我意料之外。我想来想去，也想不出个道理来。我只记得：你们大先生（鲁迅）对二太太（信子）当家，是有意见的，因为她排场太大，用钱没有计划，常常弄得家里入不敷出，要向别人去借，是不好的。”鲁老太太还说：“我说句实在话，分开倒对你们大先生有利。”“只当我少生了他（周作人）这个儿子。”
《语丝》被张作霖查封后，鲁迅担心周作人的安危，给周建人、川岛等人写信说：“他之在北，自不如来南之安全，但我对于此事，殊不敢赞一辞，因我觉八道湾之天威莫测，正不下于张作霖，倘一搭嘴，也许罪戾反而极重，好在他自有他之好友，当能相助耳。”
“我豢养了他们，他们却这样对待我。”
周建人听了这话，觉得他还不明白，还以为自己是八道湾的主人，而不明白其实他早已是一名奴隶。
1923年7月14日，鲁迅日记记载：“是夜始改在自室吃饭，自具一肴，此可记也。”17日，周作人的日记曾记载有关于他与鲁迅矛盾的内容，但被他剪去了。19日，周作人将一封绝交信交给鲁迅，信中写道：“鲁迅先生：我昨天才知道，——但过去的事不必再说了。我不是基督徒，却幸而尚能担受得起，也不想责谁，——大家都是可怜的人间。我以前的蔷薇的梦原来都是虚幻，现在所见的或者才是真的人生。我想订正我的思想，重新入新的生活。以后请不要再到后边院子里来，没有别的话。愿你安心，自重。七月十八日，作人。”这日鲁迅日记中记载：“上午启孟自持信来，后邀欲问之，不至。”8月2日，鲁迅与朱安搬出了八道湾，周作人在日记里记载：“下午L夫妇移住砖塔胡同。”L指鲁迅，周作人在日记中已不愿再提到鲁迅的名字。