抗战爆发后，友人纷纷劝周作人南下，从日本逃回国的郭沫若发表《国难声中怀知堂》说：“我自回国以来所时时怀念着的，却是北平苦雨斋中我们的知堂。……知堂如真的可以飞到南边来，比如就像我这样的人，为了掉换他，就死上几千百个都是不算一回事的。”
但周作人还是留在了沦陷的北平，他在给陶亢德的信中说：“有同事将南行，曾嘱其向王教长蒋校长代为同人致一言，请勿视留北诸人为李陵，却当作苏武看为宜。”谈到郭沫若的之文，他说：“鼎堂先生文得读，且感且愧，但不敢不勉耳。”
1938年春夏，周作人和寺内寿一的合照在香港的报纸上刊发后，文协便开除了周的会籍。
同年8月，胡适从伦敦寄给周作人一封信，信中附白话诗一首：“臧晖先生昨夜做一个梦，梦见苦雨斋中吃茶的老僧，忽然放下茶盅出门去，飘然一杖天南行。天南万里岂不太辛苦？只为智者识得重与轻。梦醒我自披衣开窗坐，有谁知我此时一点相思情。”意在劝其南下，周作人亦回诗一首，诉说自己不南下的理由：“我谢谢你很厚的情意，可惜我行脚却不能做到，并不是出了家特别忙，因为庵里住的好些老小。我还只能关门敲木鱼念经，出门托钵募化些米面——老僧始终是老僧，希望将来见得居士的面。”
周作人拒绝南下的托词为“上有老、下有小、家累重”，俞芳认为，这只不过是他的托词，鲁老太太根本不是他的负担，而当时八道湾的孩子们都已经长大，最小的是周作人女儿静子的两个孩子，“但但是八个青壮年，带两个小孩子，问题应该是不大的”。
卢沟桥事变后，北大南迁，指定年迈且患高血压的马裕藻，以及董康、周作人三人留守，保管校产。日本人占领北平后，多次命周作人请马裕藻出山任教，马裕藻让幼子马泰将周拒之门外。次数多了，马裕藻便让马泰对周说：“我父亲说了，他不认识你。”从此，周才不再登门。
周作人并非开始就有附逆之心，张铁荣在《周作人平议》中说：“北平沦陷后不久，据一位最后逃出虎穴的北大同学透露，一天，周作人从东安市场回家，路经北大二院，下车看看学校的情形，当时任翻译的日本人小林过来用日语打招呼，此人有一种大和民族的优越感，平日对教职员毫无礼貌，周作人给他一个冷面孔，毫不理会，昂首直入，小林立即改用中国话向周致意，并连连道歉，周作人还斥责了他对教职员语势之不当云云。……人们还不知道，周作人曾和马幼渔一起痛骂过当时已附逆的原北大日文教授徐某，时间是日本侵略军占据北平之后大约半年……”
1939年元旦早晨，有人冒充学生到八道湾拜访周作人，进门便抬手给了周作人一枪，子弹打中周腹部。刺客还打上了当时在周家作客的周作人弟子沈启无，在逃走时，又打死了周家的一名车夫。
周当天穿的是新棉袍，子弹穿过棉袍打在他穿的毛衣的衣扣上，只是划伤了他的皮肤，但周坚持说子弹打进肚子里了。事后到医院做了检查，并没有发现子弹，后来周在穿毛衣时发现了变形的衣扣，又在客厅找到了子弹。但周却极为惶恐，他同意由日本人安排警署派三名便衣警卫进驻其家中。出于安全考虑，他辞去了郊区的燕京大学教席，随后出任伪北大文学院院长一职。
周作人说刺客是日本人，有人说是“抗日锄奸团”，也有人说是爱国青年学生，又有人说是周作人的侄儿周丰三因无法阻止伯父当汉奸而决定干脆杀了他，与几个志同道合的同学所为。但无论哪种说法，都没有得到证实，至今是个疑案。
鲍文蔚曾问周作人为何有人要加害于他时，周轻描淡写地说：“可能有人觉得我可恶吧。”
周作人任伪职后，文化界倾力劝周作人南下，茅盾、郁达夫、老舍、冯乃超、王平陵、胡风、胡秋原、张天翼、丁玲等18人发表公开信，希望周做“文坛苏武”，“幡然悔悟，急速离平，间道南来”。当时甚至有“城可失，池可破，周作人不能投降”的口号。
周海婴记载，周作人对日本的态度越来越暧昧时，正上中学的周建人与羽太芳子的次子周丰三多次劝说二伯父悬崖勒马，周作人并不理会。周丰三郁郁寡欢，最后竟以死相谏，但周作人仍不为所动。
1941年，周作人出任伪国民政府委员、为华北政务委员会常务委员兼教育总署督办等职务，文化界一片哗然。艾青说：“周作人，在我们最需要他的时候，背叛了我们！”
依附日本人后，周作人大兴土木，翻盖了八道湾的住宅，卧室也完全改建成日式的榻榻米，家中家具、物品都从日本商店购买，家人生病也请日本医生诊治。家人过生日、过满月都要庆贺，中日车水马龙，宴席不断。张琦翔说，八道湾苦雨斋原本是学子、教授愿意来的，推门即入，不拘形迹。当周成了伪督办，翻盖房子后，给朋友们发通知说，每周一、三、五下午四至六时会客。而逢着会客日，周家有好多官僚，于是朋友们便不大到苦雨斋了。
周作人刚开始大概还抱有“学校可伪，学生不伪，政府虽伪，教育不可使伪”的想法，于浩成在《关于周作人的二三事》中说：“1941年12月8日太平洋战争爆发后，日本当局于上午七八时即按原定计划派军队进驻燕京大学，将代校长陆志韦、张东荪、赵紫宸、邓之诚等教授聚在一起，准备解去关押……听我父亲说（董鲁安，原燕京大学教授，后为晋察冀边区参议会副议长），陆志韦先生在匆忙中低声告一位懂日语、以前经常代表燕大校方与日本当局联系、办理交涉的萧先生说：‘找周岂明！’可见周作人还是起到某种缓冲甚至‘保护’作用的。”
某日，伪新民会通知北平各校学生到天安门参加庆贺皇军占领宜昌大会，教育总署请示督办周作人，周认为学生应远离政治，参加与否，无关宏旨，教育总署便按其意思通知各校。次日，各校照例放假，无一学生到会。伪新民会顾问安腾大怒，要亲自去逮捕周作人，经人力劝才作罢。自此，各校有会必到，到必抢先，而周作人则再不敢管此类事情了。
之后，周作人这个督办便进出于各类教育会议及各类讲习班、训练班，没会必到，训词、训示也是：“现在所施行的教育方针，是以亲仁善邻为主旨”，“总之，藉着教育行政的力量，以圆满达到善邻友好、共同防共、经济提携的三种目的”等。
1941年4月，周作人与钱稻荪等人赴日本出席东亚文化协议会文学部会，据当时报纸报道：“14日，周作人一行抵东京”，“上午十时晋宫问候，询问陛下康强后，更赴大宫御所秩父官邸问候。正午出席文相官邸中桥田文相主办之午餐会。下午一时半，赴高松莒御殿问候。二时半，参拜明治神宫，其次更参拜护国英灵之靖国神社，东亚永久和平之志向相同，之一行均誓言真心，径往宿舍云”。此行，周作人还慰问了在侵华战争中受伤的日本军人。
范纪曼回忆，四十年代初，周作人到中央大学讲演，当时中大在地下党员范纪曼的领导下发生了反对伪校长樊仲云的学潮。范在讲演前找到周作人说明情况，但并没有透露自己的共产党员身份，周听罢说道：“我的演讲，你们樊校长一定会失望地。我从‘五四’到‘三一八’，也是站在学生方面的。”果然，周的讲演《中国的思想问题》赢得学生们的阵阵掌声，而坐在主席台上的樊仲云等人则显得非常狼狈。
周作人任督办期间，曾多方照顾李大钊的长女李星华，帮助李星华、李光华姐弟办“良民证”，协助他们从北平转移至延安，掩护李大钊此女李炎华及其夫侯辅庭。他还曾营救中共地下党员高炎。
周作人还与国民党方面接触，曾多次找国民党北平地下市委委员沈兼士“闲谈”。抗战胜利后周作人受审时，国民党地下工作者张怀、董洗凡等人为其作证，称周曾有掩护或联名保释被捕人员的举动。
周作人一方面附和日本人的大东亚文化理论，另一方面又希望能保持知识分子的独立，他的这种矛盾，触怒了日本人。1943年8月，日本人片冈铁兵斥责周作人为“中国反动老作家”。
任伪职期间，周作人曾对友人说：“我现在好比是站在戏台上尝门便看戏的看客。”
晚年，周作人在给鲍耀明的信中说到自己任伪职的原因：“关于督办事，既非胁迫，亦非自动（后来确有费气力自己运动的人）。当然是由日方发动，经过考虑就答应了，因为自己相信比较可靠，对于教育可以比别个人出来，少一点反动的行为也。……此处又任华北综合调查研究所副理事长，当时有人也有劝我不要干的，但由于上述的理由，遂决心接受。”
60年代，周作人对张铁铮谈及他当年任伪职之事时，张说：“这是日本人‘胁迫’的。”周说：“我当时同意了，以后担任过伪职的人，受到查处是当然的。”谈及去长春见溥仪之事，周说：“我去长春是汪精卫点的名，不过我见溥仪的兴趣远不如见罗振玉兴趣大，我见到了罗振玉。”
1986年，南京师范大学《文教资料简报》发表沈鹏年的访问记录说，周作人本不愿出任伪职，出任是共产党的意思。他任职后，执行了中共向其暗示的“积极中消极，消极中积极”的方针。
而1987年，曾为中共地下工作者的许宝骙发表《周作人出任华北教育督办伪职的经过》一文，回忆说，1940年11月初，伪华北政务委员会教育总署督办汤尔和病死，当时的继任人选有二：谬斌和周作人。许宝骙、王定南、张东荪三人研究后认为，谬斌为国民党党棍，如其继任，必推行奴化教育，对青年有害。为了抵制谬，他们决定劝说周出任督办一职，反正周已经任伪北大文学院院长，“一条腿已经下了水”。许去劝说周，告知谬斌其人其事，称：“先生若以文学院长进而出仕，只要排掉了谬斌，就是一种功德。”
许多研究者认为上述二人的说法不可信，因为周作人如果真是按照共产党的意思出任伪职，他晚年又何必写信给周恩来为自己辩解？！
据时任中共北平特委书记的王定南回忆，他们当时只是研究认为周作人继任比谬斌的危害性小，他并没有委托任何人去游说周出任伪职。
对于周作人出任伪职，林辰这样说：“周作人在担任伪职期间，志得意满，兴高采烈，他穿着军装简约伪新民会青少年团；他到南京、苏州宴饮游乐，在游南京玄武湖时，还写下了‘疲车羸马招摇过，为吃干丝到后湖’这样的诗句，表现了他招摇过市、得意忘形的神情。1943年4月，周老太太去世后，他写了一篇《先母事略》，内有‘作人蒙国民政府选任为委员，当赴首都谒见主席’等语，如果他当汉奸是迫不得已，如果还有一点羞耻心，则在关于老太太的事略里，是没有必要谈到他出任国府委员和赴南京谒见大汉奸汪精卫的，而他却津津乐道，引为光宠。他常用一颗闲章，文曰‘知惭愧’，事实说明，他是一个不知羞愧的人！”
周作人的儿媳张菼芳回忆，抗战胜利后前，中共曾邀请周作人到解放区去，周没有答应。于浩成回忆，周作人托人问其父董鲁安（时任晋察冀边区参议会副议长，解放后更名于力）传达过想到解放区的意思，董将此事汇报给议长成仿吾，成一口回绝了。