1917年7月3日，蔡元培在北大发表热情洋溢的就职演说的余热未散，就向黎元洪总统提出辞职了，措辞委婉，但动因沉郁，是为抗议张勋复辟。
1918年夏，北京各校学生，曾为“中日防敌军事协定”问题，结队游行，向总统府请愿。当北大学生出发时，蔡元培曾力阻，但未果。蔡元培因此引咎辞职，经慰留而罢。
1919年5月8日，五四运动爆发后，蔡元培为抗议政府逮捕学生，于5月8日提交了辞呈。并于9日悄然离京赴天津，随即南下上海、杭州。离京前，他曾留下一则《启事》，10日即在《北京大学日刊》刊出，他写道：“我倦矣！‘杀君马者道旁儿’，‘民亦劳止，汔可小休’，我欲小休矣。北京大学校长之职，已正式辞去，其他向有关系之各学校、各集会，自五月九日起，一切脱离关系。特此声明，惟知我者谅之。”这次辞职引发广大师生挽蔡大行动，而且鉴于政府对于留蔡无表示，5月13日，北京各大专学校校长于5月13日向政府齐上辞呈，支持蔡元培。
北京大学因提倡“新文化”、“兼容并蓄”，常招致“国务院”、“参议院”等衙门的横加干涉。蔡元培非常气愤：“思想自由，是世界大学的通例。……世界哪有这种不自由的大学么？还要我去充这种大学的校长么？”1919年6月15日，蔡元培发表《不肯再任北大校长的宣言》，宣称中国现代大学的三项基本原则：第一，大学应当是独立的和自主的；第二，大学应当具有思想自由和学术自由；第三，大学学术与思想自由需要相应的自由的社会政治环境。“我绝对不能再做不自由的大学校长。”读完乃挂冠而去。
1923年1月17日，蔡元培再度愤而辞职，次日他在《晨报》刊发的辞去北大校长职务声明，区区七十余字，却如洪钟大吕：“元培为保持人格起见，不能与主张干涉司法独立、蹂躏人权之教育当局再生关系，业已呈请总统辞去国立北京大学校长之职，自本日起，不再到校办事，特此声明。”
蔡元培这次愤而辞职，缘于“罗文干案”。罗文干清末留学英国，获牛津大学法学硕士学位，归国后长期任职于司法界，时任财政总长，是北大法科兼课讲师。当时的直系军阀和部分官僚政客们一手制造了“罗文干案”，控告罗文干贪污受贿，胁迫黎元洪下令逮捕罗文干；罗文干第一次被捕后因证据不足宣布无罪释放，但新任的教育总长彭允彝却在内阁会议上提议“再来过”，结果罗文干再次被捕入狱。于是蔡元培愤怒了，他尤其对“顶头上司”、教育总长彭允彝的卑污人格憎恶万分，于是毅然提交辞呈，以示耻于为伍，并毫不留情地抨击了军阀政客们的所作所为，说“数月以来，报章所记，耳目所及，举凡政治界所有最卑污之罪恶，最无耻之行为，无不呈现于中国”，“国人十年以来最希望之司法独立，乃行政中枢竟以威权干涉而推翻之”，“元培目击时艰，痛心于政治清明之无望，不忍为同流合污之苟安，尤不忍于此种教育当局之下支持教育残局，以招国人与天良之谴责”，言辞之激烈之痛切，是历次辞呈之最。在他的辞呈以及随后的声明中，关键词是很清楚的，那就是“蹂躏人权”。
1月21日，蔡元培起草了《关于不合作宣言》，刊发在1月25日的《申报》上，其中说到：“止见他们一天一天的堕落：议员的投票，看津贴有无；阁员的位置，禀军阀意旨；法律是舞文的工具；选举是金钱的决赛；不计是非，止计利害；不要人格，止要权利。这种恶浊的空气，一天一天的浓厚起来，我实在不能再受了。”“国务员匆匆的提出再议的请求，又立刻再剥夺未曾证明有罪的人的自由，重行逮捕。而提出者又并非司法当局，而为我的职务上天天有关系的教育当局，我不管他们打官话打得怎么圆滑，我总觉得提出者的人格，是我不能再与为伍的。”
蔡元培的“不合作主义”曾引起胡适的感慨，认为“在这混浊黑暗无耻的国家里，在这怯儒不爱自由的民族里，蔡先生的不合作主义是不会成功的”。