同年五月二十一日，织田信长暂时返回岐阜重整部队，并于将近一个月后的六月十九日，再度率领大军进入近江，攻打浅井长政的小谷城。大军再度由已经建造好攻略据点的木下藤吉郎担任先锋。
织田部队迅速攻陷长竞、刈安两个堡垒，一举进逼小谷城。但由于小谷城所在位置山势险峻，浅井家又奋力抵抗，以致未能竟功。而且后来当织田家暂停攻城、预备退守之际，浅井大军竟尾随而来，造成极大的伤亡。
这场战事，木下组并没有太大的战功，倒是藤吉郎发挥了他得意的宣抚手腕，成功拉拢了长竞的守将樋口直房。这使得木下藤吉郎获得了日后在进攻浅井时担任先锋的权利，意义重大。
暂停攻打小谷城之后，六月二十四日，信长将矛头转向横山城，和德川家康的部队一起将该城团团围住。浅井长政在朝仓景健率领的万余大军驰援下，挥兵前来挽救横山城的危急局势，展开了所谓的“姉川会战”。
起初两军各据山头布阵以对，六月二十七日清晨，朝仓、浅井部队假装后退，前进至姉川附近。于是织田家也退下山头，积极迎战，结果变成朝仓一万余士兵加上浅井八千名士兵所组成的一万八千大军，和织田两万三千、德川六千共两万九千人所组成的队伍，隔着姉川对峙，准备决战。
此时，双方似乎各自摆出两列纵深的阵势。换言之，姉川的北侧是朝仓和浅井组成的联合军，朝仓在右翼（西），浅井在左翼（东）；南侧则是织田和德川组成的同盟军，织田在右翼（东），德川在左翼（西）。双方的兵力，很明显地左右不均，因此信长特别自织田大军中抽出一千人，交由稻叶通朝统帅，前往支援德川部队。六千德川部队要应付一万多朝仓部队，信长却只派出一千人前往支援，或许真的是对三河武士的骁勇善战信心十足吧。
木下藤吉郎或小一郎从未参加过如此大规模的会战，眼看强敌在前，藤吉郎兴奋得全身发抖，恨不得赶快杀敌立功，再三恳求信长派他当先锋，但信长并未接纳。当天木下秀吉的部队位在织田家十三组人马的第三阵，前面还有第一阵的坂井政尚以及第二阵的池田胜三郎恒兴，共计六千人。
尽管如此，木下组仍然全面卷入战斗。上午十时左右，浅井部队的先锋大将矶野员昌冲进敌阵，转瞬间便突破了织田部队的第一、第二阵。木下组奋力阻挡其前进，但浅井部队又陆续派出浅井政澄、阿闭贞征、新庄直赖等人，主将长政也亲率大军出击，猛烈的攻势很快就击溃了木下组的阵势。当天织田大军的十二组人马一直被突破到第九阵，直到信长的主阵才好不容易挡住对方的攻势。织田家的部队始终不擅长短兵相接的作战，也因为体认到手下士兵的弱点，信长才会那么早就开始使用并仰赖洋枪弹药。
另一方面，德川家康所率的三河士兵，果然如预期的勇猛善战。一、二阵的酒井忠次、小笠原长忠所率的两千士兵负责挡住朝仓家的攻击，家康的本队则绕至左方采取攻势，反而克制了朝仓大军，使其缓缓脱离战线。这样的结果，或许是因为担任援军的朝仓部队战斗意志不够旺盛所造成的。
差不多在这个时候，织田大军也总算来了援手。留在横山城守备的氏家直元、安藤守就的部队，眼见信长的本阵都岌岌可危，火速赶到战场，冲破浅井阵势的左翼。
因为朝仓家的撤退而露出右翼，本队左翼又遭到氏家、安藤的攻击，浅井长政终于无法支撑，撤退逃入小谷城。据说会战于当天下午两点结束，死亡人数分别是朝仓、浅井的联合军共一千七百人，织田、德川的同盟军共八百余人。朝仓、浅井虽然溃败，但死者不及一成，在军事上并未造成毁灭性的创伤，因此在会战之后还苟延残喘了很长一段时间，让织田信长深受其苦。
姉川会战告捷，织田信长故意将结果加油添醋地通知足利义昭及毛利家，以便发挥牵制的效果。为此缘故，街头巷尾也传出许多夸大的谣言，甚至绘声绘影地说浅井长政、朝仓景健均已战死沙场——连消息灵通的朝臣山科言继都在他的日记中这样写着。
当然，近江的军事情势也起了变化。
由于姉川会战时援军败退，横山城失陷，使浅井领地的南半部遭到占领，其中只剩下矶野员昌镇守的佐和山城孤立其间。
针对此，信长在其东边的百百筑寨，交给丹羽长秀镇守，又命市桥长利、水野信元、河尻秀隆进驻周围的山寨，采取包围的态势。
同时，信长也将占领来的横山城交给木下秀吉，命他监视浅井长政所在的小谷城。自此以后，横山城便成为织田家在北近江的根据地，由木下秀吉担任此地区的司令官。
于是，这两年主要负责京都奉行等行政工作的木下秀吉，再度成为前线司令官兼外交谍报官，回归军政体系。